1.觀察細胞生長狀態(tài)，取生長狀態(tài)良好的細胞去掉培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理24h。

2.將基質膠置于冰中并在4℃過夜融化，將24孔細胞嵌入皿、移液管或槍頭放入4℃預冷過夜。

基質膠鋪膠準備

3.稀釋基質膠：在冰上，將基質膠用無血清培養(yǎng)基稀釋至1mg/mL，使用預冷的吸頭混合至均勻狀態(tài)。

4.均勻鋪膠：取60μL上述混合溶液垂直加入嵌入皿中，使其均勻平鋪在底部，注意均勻鋪膠，不要產生氣泡。
5.凝膠：隨后置于37℃孵育2-4h聚合成薄膜，小心吸出未結合的基質膠。

6.基底膜水化：加入100μL無血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30min，進行水化。

細胞鋪板

7.去除嵌入皿中液體，檢查是否有液體穿過上室進入到下室中，若沒有，則可用于接種細胞。

8.用無血清培養(yǎng)基配制樣本，建議將工作液濃度設置成終濃度的2倍。隨后按樣本：細胞懸液=1：1的比例加入到嵌入皿內。

9.取500μL含10%FBS的完整培養(yǎng)基加入24孔板下室，用鑷子將嵌入皿置于24孔板內。

10.消化饑餓后的細胞，用1mL無血清培養(yǎng)基重懸，進行細胞計數，根據上室細胞接種數量調整細胞密度。

11.先加入50μL的樣本工作液，再加入50μL的細胞懸液，此時樣本濃度被稀釋2倍即為終濃度。

12.將24孔板置于37℃，5%CO₂，90%濕度條件下培養(yǎng)24-48h。

13.取出嵌入皿，去除培養(yǎng)液，在24孔板干凈的孔中加入600uL 4%多聚甲醛固定液，將小室放入孔中室溫固定15-30分鐘，棄固定液，PBS洗滌小室內外2-3次。

14.在24孔板干凈的孔中加入600uL結晶紫染色液，將小室放入孔中室溫染色8-10分鐘，棄染色液，PBS洗滌小室內外2-3次。

15.適當風干或用棉簽擦干后，在顯微鏡下觀察。

16.用小鑷子小心揭下膜，底面朝上，適當風干后，移至載玻片上用中性樹膠封片。在高倍顯微鏡下進行觀察和拍照，隨機選取5個視野(上、下、中央、左、右各1個)計數呈紫色的細胞，統(tǒng)計結果。

注：“非貼壁”細胞計數，由于某些細胞自身的原因或某些膜的關系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。這種情況下可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細胞儀計數細胞量，也可用細胞計數的方法直接在鏡下計數。

01

規(guī)格

02

膜材質

03

孔徑